Es un lugar donde su función
principal es la toma de muestras ya sean
biológicas o industriales, realización de las pruebas bioquímicas,
bacteriológicas y microbiológicas a dichas muestras y su entrega oportuna de resultados,
bajo el estricto control de calidad lo
cual hace que estos resultados sean fidedignos y exactos.
El laboratorio clínico está regido
por la 841 sobre la profesión del bacteriólogo y sus afines.
Su ubicación y arquitectura está dada
por normas registradas por el Ministerio de Protección Social.
EQUIPOS DEL LABORATORIO
CLINICO
CENTRIFUGA: Es uno de
los equipos más utilizados en el laboratorio, su función principal radica en la
separación de suero, mezclar y concentrar diferentes secreciones corporales,
tales como la orina, materia fecal, sangre anticoagulada, LCR.
MICROCENTRIFUGA: Es un equipo que se utiliza en el
área de Hematología y Banco de Sangre, pues su uso se basa en la separación de
muestras sanguíneas anticoaguladas, dentro de un capilar de vidrio, esto da
como resultado un valor llamado HEMATOCRITO. La inadecuada calibración de la
micro centrifugación puede originar resultados erróneos.
BAÑO SEROLOGICO: Es un equipo donde
bajo cierta temperatura se utiliza para realizar ciertas pruebas. Se puede
graduar a 37ºC, 45ºC, 56ºC, 60ºC.
Su función principal es darle la
temperatura adecuada para que se realicen ciertas pruebas, sin esta temperatura
las pruebas pueden dar resultados erróneos.
NEVERA: Equipo donde se guardan todos
los reactivos, muestras, que necesitan de refrigeración para su conservación.
Debe tener una temperatura entre 2-8ºC más o menos 6ºC. Evitar estar abriéndola
constantemente, con el fin de evitar la descomposición de los reactivos y
provocar el crecimiento bacteriano.
MICROSCOPIO:Es el instrumento más importante que
existe dentro del laboratorio clínico, se utiliza para observar a través de él
los diferentes especimenes que encontramos en las muestras.
INCUBADORA: Es un tipo de horno cuya
función es proporcionar una temperatura óptima para el crecimiento bacteriana
utilizada preferencialmente en el área de Microbiología.
FOTOCOLORIMETRO:Es un equipo que se utiliza en el área de química, se usa para hacer
ciertas pruebas tales como: glicemia, colesterol, triglicéridos, etc.
MATERIAL DE LABORATORIO!!
TUBOS DE ENSAYO: Recipiente de
vidrio, de volumen variable, normalmente pequeño. Sirven para hacer pequeños
ensayos en el laboratorio. Se pueden calentar, con cuidado, directamente a la
llama. Se deben colocar en la gradilla y limpiarlos una vez usados, se colocan
invertidos para que escurran. Si por algún experimento se quiere mantener el
líquido, se utilizan con tapón de rosca.
PROBETA: Recipiente de vidrio para medir volúmenes, su precisión es
bastante aceptable, aunque por debajo de la pipeta. Las hay de capacidades muy
diferentes: 10, 25, 50 y 100 ml.
BURETAS: Material de vidrio para
medir volúmenes con toda precisión. Se emplea, especialmente, para
valoraciones. La llave sirve para regular el líquido de salida.
GRADILLA: Material de madera o metal
(aluminio), con taladros en los cuales se introducen los tubos de ensayo.
PIPETAS: Recipientes de vidrio para
medir volúmenes, son de gran precisión. Las hay de capacidades muy diferentes:
0'1, 1'0, 2'0, 5'0, 10'0.............. ml (las más precisas miden μI). En
cuanto a la forma de medir el volumen, podemos distinguir entre: graduadas:
sirven para poder medir cualquier volumen inferior al de su máxima capacidad.
Ensayo por Inmunoabsorción Ligado a
Enzimas; es una técnica de inmunoensayo
en la cual un antígeno inmovilizado se detecta mediante un anticuerpo enlazado
a una enzima capaz de generar un producto detectable, como cambio de color o
algún otro tipo; en ocasiones, con el fin de reducir los costos del ensayo, nos
encontramos con que existe un anticuerpo primario que reconoce al antígeno y
que a su vez es reconocido por un anticuerpo secundario que lleva enlazado la
enzima anteriormente mencionada. La aparición de colorantes permite medir
indirectamente mediante espectrofotometría el antígeno en la muestra.
Se usa en muchos laboratorios para
determinar si un anticuerpo particular está presente en la muestra de sangre de
un paciente. Aunque el procedimiento es rutinario y sencillo, involucra a un
gran número de variables, tales como selección de reactivo, temperatura,
medición de volumen y tiempo, que si no se ajustan correctamente, puede afectar
los pasos sucesivos y el resultado de la prueba.
La interacción antígeno-anticuerpo en
el laboratorio puede ser utilizada para determinar si un paciente tiene una infección
o una enfermedad autoinmune. Pero como prueba diagnóstica, posee diversas
limitaciones que conviene conocer:
En primer lugar, un resultado
positivo que confirma la presencia de anticuerpos no significa necesariamente
que el paciente esté enfermo. El cuerpo de una persona que ha estado enferma y
que ya se ha recuperado puede seguir produciendo anticuerpos. Esto originaría
un falso positivo.
En segundo lugar, hay personas que
producen una baja cantidad de anticuerpos, por lo que estos pueden pasar desapercibidos
y no ser medidos, dando lugar a un falso negativo. Sería el caso, por ejemplo,
de personas que padezcan una inmunodeficiencia, o que se encuentren en el
periodo ventana de la infección en el momento de realizar la prueba, o que
estén infectadas por una cepa extraña.
En tercer lugar, pueden aparecer
falsos positivos cuando se da inespecificidad entre antígeno-anticuerpo.
En estos casos de diagnóstico de
enfermedad, es recomendable la eliminación (mediante centrifugación) de células
de la sangre que puedan interferir con el ensayo y puedan ocasionar un
resultado falso positivo, careciendo aquel de especificidad. También, debemos
tener en cuenta que cuando se trata de diagnosticar una enfermedad que posee un
valor predictivo positivo bajo en una determinada población —es decir, que esa
enfermedad tiene muy baja incidencia en dicha población—, es necesario volver a
confirmar el resultado positivo mediante otro método de diagnóstico
independiente. Normalmente, se lleva a cabo un western blot donde se detecta la
presencia de varios anticuerpos, simultáneamente, frente a la misma infección
en una muestra. El resultado del western se considera positivo cuando aparecen
al menos 5 bandas, que indica que 5 anticuerpos diferentes están presentes en
el sujeto frente a esa infección. Es entonces cuando se diagnostica como
positivo a dicho paciente.
Este principio tiene muchas de las
propiedades de un inmunoensayo ideal: es versátil, robusto y simple en su
realización, mediante el uso de la fase sólida, una separación fácil entre la
fracción retenida y la fracción libre.
Además se han propuesto y
desarrollado diferentes métodos de amplificación de la señal (luminiscentes,
cascadas enzimáticas...) que han permitido elevar la sensibilidad de algunos
ELISA a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal.
Este método ha tenido una enorme
aplicación en todos aquellos campos en los que se precisaba la cuantificación
de productos mediante anticuerpos: diagnóstico clínico, detección viral,
clasificación de anticuerpos en isotipos, búsqueda de anticuerpos monoclonales,
etc.
DISPOSITIVOS EMPLEADOS
EN ELISA
Se han ensayado numerosas fases
sólidas, desde los tubos de cristal de los orígenes hasta las actuales
microplacas de 96 pocillos de plástico tratado, para aumentar su capacidad de
adsorción (en su superficie) de moléculas, y con fondos de pocillo ópticamente
claros que permitan realizar las medidas de densidad óptica en instrumentos
específicos, espectrofotómetros de lectura de placas que han recibido el nombre
de lectores ELISA.
Actualmente se están desarrollando
dispositivos de mayor capacidad.
Los lectores ELISA son
espectrofotómetros capaces de realizar lecturas seriadas de cada uno de los
pocillos de la placa ELISA. A diferencia de un espectrofotómetro convencional,
con capacidad de leer todas las longitudes de onda del ultravioleta y el
visible de manera continua, los lectores de ELISA disponen de sistemas de
filtros que solo permiten la lectura de una o pocas longitudes de onda; son la
que se corresponden con las necesarias para determinar la densidad óptica de
los cromógenos más comúnmente utilizados.
FASES DE UN ENSAYO
ELISA
LAS CUATRO FASES DE UN
ENSAYO ELISA SON LAS SIGUIENTES:
üConjugación del anticuerpo o del antígeno con una enzima (peroxidasa,
fosfatasa alcalina...): El anticuerpo conjugado a la enzima se emplea en los
ensayos directos e indirectos, sandwich, etc. El antígeno marcado se emplea en
ensayos de competición de antígeno. Dicha unión anticuerpo-enzima o
antígeno-enzima ha de producirse durante un determinado período de tiempo en
aras de producir una solución coloreada y que pueda ser valorada visualmente o
cuantificada por medio de un espectrofotómetro (normalmente a una longitud de
onda de 414 nm). Si no transcurre el tiempo adecuado para que se dé la
reacción, no se evidenciará ningún color, interpretándose este resultado como
un falso negativo y disminuyendo la sensibilidad de la técnica.
üUnión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos: La unión de
anticuerpos o antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos
tratados que tienen gran afinidad por proteínas. Así, el procedimiento de
recubrimiento de los pocillos debe realizarse cuidadosamente. Si se usa mucho
antígeno, se pueden obtener falsos positivos. Por el contrario, si se usa poco
antígeno, el exceso dará lugar a una reacción falsa negativa.
üFormación de una o más capas de inmunocomplejos: En el caso del antígeno
unido a la placa, se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno
marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un
secundario anti-primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite
la amplificación de la señal al poderse unir uno o más anticuerpos secundarios
a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa, se
incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan diferentes
relaciones de antígeno frío frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es
el ensayo de competición del antígeno. En esta etapa es muy importante
controlar los factores tiempo y temperatura de incubación para evitar la
aparición de falsos negativos. En el caso del tiempo, si es inferior a 15
minutos, no ocurrirá la interacción antígeno-anticuerpo y el color no será
evidente al final del ensayo, dando un falso negativo. Por su parte, si la
temperatura de incubación es muy baja, la formación del complejo
antígeno-anticuerpo tampoco se completará en el tiempo establecido, mientras
que si es muy alta, las proteínas (antígeno y anticuerpo) se desnaturalizan y,
por tanto, disminuyen su capacidad para interaccionar, dando igualmente falsos
negativos.
üRevelado de la reacción enzimática: Después de un lavado para eliminar
todas las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos, se añade
el sustrato enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad
óptica mediante espectrofotometría.
TIPOS DE ENSAYOS ELISA
üELISA DIRECTO :(ensayo ELISA simple de dos capas). Las placas ELISA se
preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se
encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la
presencia de antígeno en la solución analizada. Es necesario incluir controles
negativos que serán muestras del mismo tipo que las analizadas (sangre,
orina...), pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antígeno
buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se
encuentra el antígeno buscado).
üELISA INDIRECTO: Las placas ELISA se preparan de la misma forma a la
anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección
emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antígeno y uno secundario
marcado contra el primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar
una amplificación de señal debida a la unión de dos o más anticuerpos
secundarios por cada primario. Es el ensayo más popular, como lo es la
inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo
sistema enzimático permiten cuantificar una gran variedad de antígenos; por eso
es un método más polivalente y barato, aunque se pierda algo de precisión por
tener un eslabón más con respecto al método directo. La dilución de la solución
que contiene el anticuerpo primario .
El ELISA indirecto es
el método de elección para detectar la presencia de anticuerpos séricos contra
el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH), agente causante del síndrome de
inmunodeficiencia adquirida (SIDA). Según esta técnica, proteínas recombinantes
de la envoltura y el núcleo del VIH se absorben como antígenos en fase sólida a
los pocillos. Las personas afectadas de VIH producen anticuerpos séricos contra
epítopos en estas proteínas víricas. En general, el ELISA indirecto permite
detectar anticuepos séricos contra VIH desde las primeras seis semanas de una
infección.
üELISA «sándwich» (Ensayo de captura de antígeno y detección mediante
inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el
pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de
anticuerpo, se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno,
que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo.
Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido, se aplica una
solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así, pues, cada
molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y
un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran
especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el
segundo anticuerpo.
La nefelometría es un
procedimiento analítico que se basa en la dispersión de la radiación que
atraviesan las partículas de materia. Cuando la luz atraviesa un medio
transparente en el que existe una suspensión de partículas sólidas, se dispersa
en todas direcciones y como consecuencia se observa turbia. La dispersión no
supone la pérdida neta de potencia radiante, solo es afectada la dirección de
la propagación, porque la intensidad de la radiación es la misma en cualquier
ángulo. La intensidad depende de: el número de partículas suspendidas, su
tamaño, su forma, los índices refractivos de la partícula y del medio
dispersante, y la longitud de onda de la radiación dispersada. La relación
entre variables y es más factible un tratamiento teórico, pero debido a su
complejidad raras veces se aplica a problemas analíticos específicos.
El procedimiento
generalmente es empírico y sólo se consideran 3 factores:
1. La concentración:
Mayor sea el número de partículas, mayor es la dispersión.
2. Tamaño de la
partícula: Factores como el pH, la velocidad y orden de la mezcla,
concentración de los reactivos, duración del estado de reposo y la fuerza
iónica.
3. Longitud de onda:
Generalmente las muestras se iluminan con luz blanca, pero si están coloreadas,
se debe escoger una porción del espectro electromagnético en la que la
absorción del medio se reduzca al mínimo.
En las muestras se
agregan agentes tensoactivos (como gelatina), para prevenir la coagulación del
coloide. Sólo se obtienen datos confiables si se controlan escrupulosamente las
variables que afectan el tamaño de partículas.
APLICACIÓN DE LA
NEFELOMETRIA
Generalmente,
nefelometría y turbidimetría se utilizan en el análisis de la calidad química
del agua para determinar la claridad y para el control de los procesos de
tratamiento.
Estos métodos pueden
ser también apropiados para ensayos cuantitativos que usan complejos
antígeno-anticuerpo o para medir la cantidad de proteínas en fluidos. Las
medidas turbidimétricas y nefelométricas ocupan una posición destacada en los
laboratorios clínicos. Se han aplicado para la determinación de
inmunoglobulinas, proteínas del complemento, proteínas de fase aguda, proteínas
de coagulación entre otras.
Cuando la luz atraviesa
un medio transparente en el que existe una suspensión de partículas sólidas, se
dispersa entodas direcciones y como consecuencia se observa turbia.
El aparato utilizado es
el nefelómetro en el que el detector se ubica con un ángulo que oscila entre
los 15 y 90º , suele utilizarse paraconcentraciones mas diluidas y estas son
las partes que lo componen.
Es una técnica de separación de moléculas según la movilidad de estas en un campo eléctrico.
Las separación puede realizarse sobre la superficie hidratada de un soporte solido.
La gran mayoría de macromoleculas estan cargadas electricamente y al igual que los electrolitos, se pueden clasificar en fuertes y débiles dependiendo de la constante de ionización de grupos ácidos y básicos.
PARÁMETROS QUE INFLUYEN EN LA
MOVILIDAD ELECTROFORÉTICA:
La cromatografia es un método físico para la separación para
la caracterización de mezclas complejas, la cual tiene aplicación en todas las
ramas de la ciencia.
Su objetivo es separar los distintos componentes de una
mezcla permitiendo identificar y determinar las cantidades de dichos
componentes.
FUNCIONES
Puede cumplir dos funciones básicas que no se excluyen mutuamente:
·Separar los componentes de la mezcla, para
obtenerlos más puros y que puedan ser usados posteriormente (etapa final de
muchas síntesis).
·Medir la proporción de los componentes de la
mezcla (finalidad analítica). En este caso, las cantidades de material
empleadas son pequeñas.
Las distintas
técnicas cromatográficas se pueden
dividir según cómo esté dispuesta la fase estacionaria:
Cromatografía plana la fase estacionaria se
sitúa sobre una placa plana o sobre un papel. Las principales técnicas son:
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